菌種保藏的方法

　　1、沙土保藏法。取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機質(zhì)。倒去酸水，用自來水沖洗至中性。烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。

　　2、濾紙保藏法。將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0.6×8cm的安瓿管中，每管1-2張，塞以棉塞，1.05 kg/cm，121℃滅菌30分鐘。將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下。需要使用菌種，復活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設備。

　　3、寄主保藏法。寄主保藏法用于尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法，其中最常見的是甘油管冷凍保藏法。

　　4、甘油管保存法。甘油管冷凍保藏法是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液。取1ml滅菌甘油放入與菌液充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，于-70℃下凍存。-20℃保存時間較短�；虿捎皿w積比為8：2的甘油-生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至-20℃冰箱保存。該方法適用于一般細菌的保存，同時也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油-生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營養(yǎng)成分，從而更好地保護了待保存的菌株。

　　5、冷凍干燥保藏法。先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥），其中真空冷凍干燥法最常見。真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。真空冷凍干燥法是在低溫下快速將細胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細胞的損害，要采用保護劑來制備細胞懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過程中起到保護作用的溶質(zhì)，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細胞成分的構型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。